El ácido ribonucleico ribosómico o ribosomal (ARNr o rRNA por sus siglas en inglés) es el tipo de ARN más abundante en las células y forma parte de los ribosomas que se encargan de la síntesis de proteínas según la secuencia de nucleótidos del ARN mensajero. Está formado por una sola cadena de nucleótidos (aunque presenta regiones de doble hélice intracatenaria).
Los ARN ribosómicos se han venido denominando tradicionalmente según su coeficiente de sedimentación, medido en svedbergs (S). De esta manera, en organismos procariotas existen tres ARNr distintos (5S, 16S y 23S) y en organismos eucariotas cuatro (5S, 5'8S, 18S, 28S).
En procariotas los ARNr 23S y 5S forman parte de la subunidad mayor de los ribosomas, mientras que el ARNr 16S forma parte de la subunidad menor.
En eucariotas los ARNr (ribosomales) 5S, 5'8S y 28S forman parte de la subunidad mayor de los ribosomas, mientras que el ARNr 18S forma parte de la subunidad menor.
En ambos casos, sobre el armazón constituido por los ARNr se asocian (dentro del núcleo celular) proteínas específicas, formando las subunidades ribosomales, que salen a través de los poros de la membrana nuclear al citoplasma lugar en el que desarrollan su función de síntesis proteica
martes, 11 de diciembre de 2012
5.1.3.4 Secuencias mitocondriales
La investigación de las características moleculares del genoma mitondrial (ADNmt) han sido
una de las primeras herramientas en ser exitosamente empleadas tanto en el campo de la
Antropología Molecular como en el de Genética Forense. Su análisis fue optimizado en forma
paulatina partiendo de los análisis de polimorfismos de restricción, empleados inicialmente,
hasta la secuenciación completa del genoma mitocondrial. Las características hereditarias del
ADNmt, restringida a la matrilínea y la ausencia de recombinación hacen de la información
polimórfica presente en la molécula de 16.569 pares de bases (pb) de longitud un elemento
identificatorio que posibilita el rastreo de un linaje materno o bien la correlación entre una
evidencia criminal y un posible emisor de la misma.
5.1.3.3 Micro satélites
Los microsatélites son tramos de secuencias simples de ADN con un alto grado de hipervariabilidad siendo abundantes y estando bien distribuidos en el genoma de eucariotas. Estas secuencias simples consisten en segmentos cortos de ADN con motivos repetidos, de 1 a 6 pares de bases, normalmente dinucleótidos, como ejemplo, la repetición simple de CA/TG que ocurre miles de veces en el genoma. El polimorfismo de los microsatélites viene dado por el número de repeticiones en un determinado locus, revelados como variación en la longitud de los fragmentos de los productos de PCR. Aunque los microsatélites se han usado ampliamente en genética molecular, todavía no se ha identificado su función en el genoma, la hipótesis más aceptable es que intervienen en el empaquetado y la condensación del ADN dentro de los cromosomas de eucariotas.
Los microsatélites están precedidos por unas secuencias flanqueantes o “primers” que deben ser determinadas, para su amplificación mediante PCR, pero, una vez hecho esto, debido a su alto nivel de polimorfismo, se pueden empelar en diferentes tipos de individuos; ya que se ha demostrado que se conservan entre diferentes poblaciones o razas de una misma especie, o incluso entre especies emparentadas como las gallinas y los pavos.
Tienen la ventaja de ser multialélicos, altamente polimórficos, con herencia mendeliana co-dominante, interpretación sencilla de los resultados, reproducibilidad muy alta, resultados transferibles entre laboratorios y posible automatización, además de obtenerse por PCR, por lo que se necesitan pequeñas cantidades de ADN. Por ello son herramientas apropiadas para el mapeo de ligamiento, identificación de QTL (quantitative trait loci), estimación de relaciones genéticas (distancias genéticas) entre diferentes poblaciones y tests de paternida; por lo tanto, se ha convertido en una técnica estándar para la evaluación molecular genética de cualquier población animal y humana.
http://artigoo.com/marcadores-de-adn-microsatelites
Los microsatélites están precedidos por unas secuencias flanqueantes o “primers” que deben ser determinadas, para su amplificación mediante PCR, pero, una vez hecho esto, debido a su alto nivel de polimorfismo, se pueden empelar en diferentes tipos de individuos; ya que se ha demostrado que se conservan entre diferentes poblaciones o razas de una misma especie, o incluso entre especies emparentadas como las gallinas y los pavos.
Tienen la ventaja de ser multialélicos, altamente polimórficos, con herencia mendeliana co-dominante, interpretación sencilla de los resultados, reproducibilidad muy alta, resultados transferibles entre laboratorios y posible automatización, además de obtenerse por PCR, por lo que se necesitan pequeñas cantidades de ADN. Por ello son herramientas apropiadas para el mapeo de ligamiento, identificación de QTL (quantitative trait loci), estimación de relaciones genéticas (distancias genéticas) entre diferentes poblaciones y tests de paternida; por lo tanto, se ha convertido en una técnica estándar para la evaluación molecular genética de cualquier población animal y humana.
http://artigoo.com/marcadores-de-adn-microsatelites
5.1.3.2 RAPD
La amplificación aleatoria de ADN polimórfico, más conocida por el acrónimo inglés RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), es un tipo de marcador molecular basado en la reacción en cadena de la polimerasa. Los fragmentos de ADN obtenidos por medio de esta técnica se amplifican en regiones aleatorias del genoma ya que los iniciadores o cebadores de la reacción son secuencias arbitrarias de ADN sintético. Es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Es muy cómoda, rápida, requiere poco ADN que además no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y simultáneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a ADN ligado a algún carácter, sino redundante, y que no da información sobre el número de copias que el ADN genómico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnología ha sido utilizada para análisis de diversidad genética mejoramiento genético y diferenciación de líneas clonales.
5.1.3.1 AFLP
Los polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados, más conocidos por su acrónimo inglés AFLP ("Amplified fragment length polymorphism"), son un tipo de marcador molecular que está basado en la restricción del ADN genómico mediante enzimas de restricción y en la subsecuente amplificación de algunos de esos fragmentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Son una herramienta poderosa de análisis del genoma dado que poseen un alto poder de detección de la variabilidad genética. El ensayo de AFLP combina la especificidad, resolución y poder de muestreo de la digestión con enzimas de restricción con la velocidad y practicidad de la detección de polimorfismos mediante PCR, sin necesidad de disponer de información previa del genoma a estudiar. La técnica de AFLP es propiedad de la empresa de biotecnología holandesa KeyGene.
5.1.3 Marcadores moleculares
Fragmentos específicos de ADN que pueden ser identificados en todo el genoma.
Los marcadores moleculares están situados en lugares específicos del genoma. Se usan para “marcar” la posición de un gen en concreto o la herencia de una característica particular. En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador molecular esté presente, ya que el marcador indica la presencia de la característica deseada.
Los marcadores moleculares están situados en lugares específicos del genoma. Se usan para “marcar” la posición de un gen en concreto o la herencia de una característica particular. En un cruzamiento genético, las características de interés seguirán generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden seleccionar individuos en los que el marcador molecular esté presente, ya que el marcador indica la presencia de la característica deseada.
Fuente: GreenFacts basado en el estudio sobre Cultivos modificados genéticamente de GreenFacts
5.1.2 Northern
Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
Procedimiento
El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Geles
Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.
Sondas
Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana. Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot. Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.
Procedimiento
El procedimiento general comienza con la extracción del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. El mRNA se puede aislar a través del uso de cromatografía para mantener solamente los ARN con colas de poli-A. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán tranferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
Geles
Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel. Suele utilizarse además un patrón de RNA con muestras de tamaño conocido para poder extrapolar el tamaño de las muestras en estudio.
Sondas
Las sondas del northern blot están compuestas por ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a todo o parte del RNA que nos interesa. Pueden ser de DNA, RNA o oligonucleótidos, con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana. Las sondas de RNA o ribosondas que se transcriben in vitro ayudan a prevenir el ruido de fondo. Normalmente, el DNA complementario se sintetiza con cebadores para la secuencia RNA de interés para actuar como sonda en el Northern blot. Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P) o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las cuáles, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. El marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar con compuestos radioactivos.
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