3.4.3 Fusión de protoplastos

La técnica de fusión de protoplastos surge como especialidad o aplicación a partir de las técnicas de aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la obtención de células desprovistas de pared celular gracias a la acción de enzimas líticos (celulasas, pectinasas) obtenidos de microorganismos (Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su posterior crecimiento (división celular, formación de microcallos y regeneración de plántulas por vía organogénica o embriogénica).
Aunque circunstancialmente ocurren fusiones espóntaneas entre protoplastos, y en este hecho se encuentra el origen de esta técnica, es necesario aumentar la eficacia del proceso y «dirigirlo» mediante sistemas de inducción adecuados. Los procesos de inducción son de dos tipos: Químicos, en ellos se usan sustancias aglutinantes como el polietilenglicol (PEG) o el dimetilsulfóxido (DMSO) y, Físicos, como la electrofusión, que consiste en la inducción de una dipolarización de los protoplastos mediante corrientes alternas de alta frecuencia, que van a hacer contactar y alinearse a los protoplastos siguiendo las líneas del campo eléctrico generado, y en ese momento con un pulso de corriente continua se consigue la fusión de las células.
La población de células resultantes de estos procesos de fusión va a ser una mezcla de protoplastos parentales, homocariontes y heterocariontes con dos o mas núcleos.
Para seleccionar los productos de fusión de interés, es necesario utilizar medios restrictivos para células no híbridas, o que produzcan una proliferación diferencial para las células híbridas y/o incorporar un sistema de marcaje que permita reconocer y seleccionar los productos híbridos. Un tipo de selección clásico es el basado en la complementación de mutantes no alélicos (por ejemplo la combinación de dos mutaciones recesivas albinas no alélicas que permiten la detección de los híbridos simplemente por su color; Melchers y Labib, 1974), existiendo otros muchos métodos de selección (incorporación de mutaciones de deficiencia, de resistencia, etc.) y tambien métodos de verificación del caracter híbrido en plántulas regeneradas, como el examen de los patrones morfológicos y/o isoenzimáticos.

http://www.encuentros.uma.es/encuentros35/protofus35.html